正就讀中學的少年邁爾斯（沙梅克·摩爾 配音）意外被一只遭受放射性污染的蜘蛛咬傷，隨后身體發生奇特的變化。偶然機緣，他目睹了蜘蛛俠（克里斯·派恩 配音）和犯罪頭目金并（列維·施瑞博爾 飾）為爭奪時空對撞機的戰斗。蜘蛛俠在阻止金并利用該裝置擾亂宇宙秩序時壯烈犧牲，而未過多久，來自平行宇宙的頹廢中年彼得·帕克（杰克·約翰遜 配音）意外出現在邁爾斯面前。為阻止金并重啟對撞機徹底撕裂多元宇宙，并幫助這個彼得返回原宇宙，兩人闖入金并的老巢。行動中他們遭遇章魚博士和徘徊者的狙擊，并意外觸發對撞機，導致六個不同時空的蜘蛛俠英雄——包括女蜘蛛俠、暗影蜘蛛俠、蜘豬俠、二次元蜘蛛妹等相繼現身。這些跨越維度的戰士在培訓邁爾斯掌握超能力的過程中產生分歧，最終通過團隊協作與犧牲，在布魯克林決戰中成功摧毀對撞機。金并因拒絕撤離實驗室而被坍塌建筑掩埋，各宇宙蜘蛛俠在完成使命后陸續返回各自時空。