漸漸習慣了現代生活的美國隊長史蒂夫·羅杰斯（克里斯·埃文斯飾），在一次行動后察覺神盾局內部潛藏危機。當他發現九頭蛇通過預測分析技術主導的"洞察計劃"意圖清除潛在威脅時，矛盾徹底激化。神盾局指揮官尼克·法瑞（塞繆爾·杰克遜飾）遭武裝分子襲擊前，將包含九頭蛇滲透神盾局長達數十年的關鍵證據U盤交給美國隊長。前局長亞歷山大·皮爾斯（羅伯特·雷德福飾）借機誣陷史蒂夫殺害法瑞并全球通緝，實則其本人正是九頭蛇臥底。逃亡中的史蒂夫與黑寡婦（斯嘉麗·約翰遜飾）、獵鷹（安東尼·麥凱飾）組成三人組，在破解U盤數據過程中，發現被洗腦改造為"冬日戰士"的巴基·巴恩斯（塞巴斯蒂安·斯坦飾）竟是自己二戰時期的摯友。通過與九頭蛇特工"交叉骨"（弗蘭克·格里羅飾）的殊死對抗，他們成功劫持三艘搭載核武器的主力艦并啟動自毀程序，在華盛頓紀念碑上空當眾揭露九頭蛇滲透神盾局的驚天陰謀。