拉瑞（本·斯蒂勒飾）因在紐約自然歷史博物館擔任警衛期間展現的領導能力，升任某家電器公司CEO并在電視訪談中獲得公眾關注。然而當他重返博物館時，發現館長計劃將舊展品轉移至華盛頓史密森國家博物館。為守護這些夜間復活的伙伴，拉瑞自愿留下擔任最后一晚警衛，召集羅斯福（羅賓·威廉姆斯飾）、林肯、拿破侖等歷史人物共同阻止搬遷。在修復黃金碑觸發的魔法效應后，他們意外遭遇古埃及法老卡門拉率領的復活軍團。為爭奪掌控博物館魔力的黃金碑，雙方在史密森博物館展開決戰。最終拉瑞與同伴們通過團隊協作擊潰卡門拉，將黃金碑歸還原始位置，使所有展品獲得永久魔法許可。這場冒險不僅保全了博物館的奇幻傳統，也讓拉瑞重新認識到責任與傳承的意義。