印第安納·瓊斯博士（哈里森·福特飾）與父親老瓊斯教授（肖恩·康納利飾）因圣杯傳說陷入雙重危機：記載圣物線索的碑石出土后，納粹勢力與十字劍兄弟會同時展開爭奪。為破解圣杯之謎，瓊斯在威尼斯與考古學家史奈達博士（艾莉森·杜迪飾）接頭，兩人從圣馬可圖書館取得關鍵線索——刻有十字劍標記的青銅盾時遭遇刺客追殺。逃亡途中，瓊斯發現史奈達真實身份是納粹間諜，父親留下的筆記被劫持。通過解讀筆記，父子在伊斯坦布爾重逢并揭露最終線索：圣杯藏于亞琛大教堂的最后試煉。面對納粹少校艾特曼（邁克爾·伯恩飾）的武裝威脅，瓊斯父子穿越致命機關抵達圣所，在血池、刀陣與文字謎題的四重考驗后，老瓊斯以傷換得圣杯。危急關頭，印第安納拒絕將圣物交給納粹，導致教堂坍塌。史奈達因觸碰圣杯墜入深淵，艾特曼則被機關斬首。最終瓊斯帶著垂危的父親逃出生天，圣杯隨遺跡崩塌永沉地底。